Зустрічальність ДНК основних типів онкогенних вірусів у структурі плоскоклітинного раку та нормальної слизової оболонки порожнини рота
Машинний переклад
Оригінальна стаття написана мовою RU (посилання для прочитання) .
Резюме
Актуальність. Захворюваність злоякісними новоутвореннями слизової оболонки порожнини, а найголовніше – смертність від цієї патології все ще залишається на значному рівні в Україні. У зв'язку з цим пошук інформативних прогностичних і предиктивних факторів є актуальним завданням фахівців, які займаються лікуванням пухлин слизової оболонки порожнини рота.
Мета. Визначення частоти виявлення ДНК онкогенних вірусів у нормальній слизовій оболонці та в осередках плоскоклітинного раку слизової оболонки порожнини рота.
Матеріали та методи. Проведено проспективне дослідження, в яке включено 50 здорових добровольців та 116 хворих з вперше верифікованим плоскоклітинним раком слизової оболонки порожнини рота. У всіх обстежених проведено виявлення ДНК ВПГ I, II типів, ЦМВ, ЕБВ, ВПЧ-6,11 типів, ВПЧ-16 та ВПЧ-18 типів за допомогою ПУР в реальному часі.
Результати. Було виявлено достовірно рідшу зустрічальність ДНК ВПЛ-18 у хворих плоскоклітинним раком порівняно з нормальною слизовою оболонкою (ВПЛ-18 виявлявся в 2,8 рази рідше (р < 0,0001)). У структурі плоскоклітинного раку та нормальною слизовою оболонкою порожнини рота виявлено достовірно частішу асоціацію нормальною слизовою оболонкою порожнини рота з ВПЛ-18, як у моноасоціації – 19 (18,0%) випробуваних у контрольній групі в порівнянні з основною групою – 6 (5,2%) (р=0,008), так і в комбінації з вірусом Епштейна – Барра: 7 (14,0%) (контрольна група) в порівнянні з 5 (4,3%) (основна група) (р = 0,03). Також достовірні відмінності отримані при аналізі комбінації ВПЛ-18 з цитомегаловірусом, яке було виявлено тільки в контрольній групі – 2 (4,0%) (p = 0,03).
Висновок. Проведений аналіз дозволяє припустити, що наявність ДНК ВПЛ, тип 18, у клітинах плоскоклітинного раку слизової оболонки порожнини рота може бути фактором сприятливого перебігу захворювання.
Захворюваність злоякісними новоутвореннями слизової оболонки порожнини, а найголовніше – смертність від цієї патології все ще залишається на значному рівні як у світі в цілому, так і в Україні зокрема. За даними МНІОІ ім. П.А. Герцена (філіал ФГБУ «НМІЦ радіології» МОЗ Росії), щорічна смертність від цієї патології (за даними 2017 року) наближається до 50% від усіх вперше виявлених випадків захворювання. Морфологічне формування вогнища плоскоклітинного раку слизової оболонки порожнини рота є складним багатоступеневим процесом, і основоположними етіологічними факторами його розвитку є куріння, зловживання алкоголем і неадекватна гігієна порожнини рота, які згубно впливають на структуру нормальної слизової оболонки, особливо у осіб, що мають генетичну схильність до розвитку онкологічної патології. Окрім загальновідомих факторів ризику виникнення плоскоклітинного раку слизової оболонки порожнини рота та зареєстрованих передпухлинних захворювань, існує цілий ряд факторів, таких як вірусні інфекції та запалення, які, можливо, можуть бути важливим ланкою в патогенезі злоякісних захворювань і можуть потенціювати розвиток 15-20% злоякісних новоутворень.
Мета дослідження
Визначення частоти виявлення ДНК вірусів простого герпесу I та II типів (ВПГ-I,II), цитомегаловірусу (цМВ), вірусу Епштейна – Барра (ЕБВ) та вірусів папіломи людини 6, 11, 16 та 18 типів (ВПч-6,11, ВПч-16, ВПч-18) в нормальній слизовій оболонці порожнини рота та осередках плоскоклітинного раку слизової оболонки порожнини рота.
Матеріали та методи дослідження
Для досягнення поставленої мети проведено проспективне дослідження, в яке були включені 50 здорових добровольців (контрольна група), які перебували на диспансерному спостереженні в клініці щелепно-лицевої та пластичної хірургії ГБОУ ВПО зПбГМУ ім. акад. І.П. Павлова в період з 2012 по 2013 рр. та 116 хворих (основна група), яким вперше було верифіковано діагноз «плоскоклітинний рак слизової оболонки порожнини рота» в зПб ГБУЗ «Міський клінічний онкологічний диспансер» в період з 2012 по 2013 рр. Загальний період спостереження тривав до 17.07.2019 р., після чого був проведений остаточний аналіз даних.
Основні критерії включення хворих плоскоклітинним раком слизової оболонки порожнини рота в дослідження:
Підписання форми добровільної інформованої згоди для участі в дослідженні.
Вік, старше 18 років.
Морфологічна верифікація діагнозу «плоскоклітинний рак слизової оболонки порожнини рота».
Основні критерії невключення хворих плоскоклітинним раком слизової оболонки порожнини рота в дослідження:
Виявлені віддалені метастази плоскоклітинного раку слизової оболонки порожнини рота.
Основні критерії включення в групу здорових добровольців:
Підписання форми добровільної інформованої згоди для участі в дослідженні.
Вік, старше 18 років.
Відсутність зареєстрованих на момент включення в дослідження захворювань слизової оболонки порожнини рота запального, пухлинного або іншого характеру.
Основні критерії невключення в групу здорових добровольців:
Гістологічна верифікація діагнозу «плоскоклітинний рак слизової оболонки порожнини рота».
Загальна характеристика хворих плоскоклітинним раком слизової оболонки порожнини рота.
В основній групі було 77 чоловіків (66,38 %) і 39 жінок (33,62 %). середній вік пацієнтів склав 60,80 ± 0,96 років (95% ДІ 58,90-62,70).
У 49 (42,24%) хворих первинний пухлинний вогнище локалізувався в області передньої та середньої третини язика, у 32 (27,60%) була слизова оболонка дна порожнини рота. слизова оболонка альвеолярної частини нижньої щелепи була уражена у 8 (6,90%) хворих, щока – у 7 (6,03%) хворих. Рідше уражалися передня небна дужка та слизова оболонка крилоподібної складки – у 3 (2,59%) хворих, альвеолярний відросток верхньої щелепи, ретромолярна область і тверде небо – у 2 (1,72%) хворих, а м'яке небо та нижня губа – у 1 (0,86%) хворого відповідно.
Ранні стадії хвороби (0, I та II) були діагностовані у 24 (20,69%) хворих (1,72%, 5,17% та 13,80% відповідно). У 18 (15,52%) хворих була виявлена III стадія захворювання, а більше половини хворих – 68 (58,62%) первинно звернулися вже з IVА стадією. У 6 (5,17%) хворих первинна пухлина була визнана неоперабельною (T4b) або ураження регіонарних лімфатичних вузлів перевищувало 6 см (N3) – IVB стадія.
Проведене гістологічне дослідження виявило, що у 35 (30,17%) диференціація пухлини була високою (G1), у 34 (29,31%) – помірною (GII), а у 13 (11,21%) хворих ступінь диференціації пухлини була низькою (GIII). У третині випадків – 34 (29,31%) – ступінь диференціації не була визначена.
В 51 (43,97%) випадку були виявлені гістологічні ознаки ороговіння, в 29 (25,00%) випадках пухлина не мала ознак ороговіння, в 5 (4,31%) ступінь ороговіння була визначена як часткова, а в 31 (26,72%) зразку наявність ороговіння не оцінювалася.
Загальна характеристика здорових добровольців.
Групу здорових добровольців склали 30 (60,0%) чоловіків і 20 (40,0%) жінок. середній вік склав 55,7 років (95% ДІ 47,60-61,35).
34 (68,0%) респонденти звернулися за консультацією щодо дентальної імплантації, 12 (24,0%) респондентам показана хірургічна підготовка до ортодонтичного лікування і 4 (8,0%) респонденти були проконсультовані щодо ретації/дистопії зубів. сформовані групи були співставні за демографічними показниками – статтю та віком.
Методика виявлення ДНК вірусів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в реальному часі.
Забір матеріалу проводили під місцевою інфільтраційною анестезією з первинної пухлини хворих плоскоклітинним раком слизової оболонки порожнини рота і ясен верхньої або нижньої щелепи здорових добровольців; розмір зразка складав 0,5 х 0,5 см. Після забору, зразок фіксували в розчині етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА) і заморожували при температурі –25 °C.
Виявлення вірусної ДНК здійснювали за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі (Лабораторія молекулярної діагностики ГБОУ ВО ПсПбГМУ ім. І.П. Павлова). Для якісного виявлення ДНК використовували спеціалізовані діагностичні набори, відповідно до інструкцій фірм-виробників. чутливість ПЦР-методів стандартно становила 102 генокопії в одній пробі.
Методика статистичного аналізу.
Змінні, що відображають ознаки, аналізувалися за допомогою описової статистики. з метою визначення використовуваних описових категорій кількісних змінних вони були оцінені на нормальність розподілу з застосуванням тесту Шапіро – Уілка. У всіх випадках отримані дані підпорядковувалися нормальному розподілу, у зв'язку з чим їх опис проводилося за допомогою середнього вибіркового та помилки середнього (M ± m). порівняння груп випробуваних за частотою зустрічальності ознаки проводили з використанням z-критерію (з поправкою Йетса на неперервність). Усі показники розраховувалися з двостороннім 95% довірчим інтервалом (ДІ) та значенням двостороннього «р». статистична обробка проводилася за допомогою пакета прикладних програм Statistica® (StatSoft, ver. 12.0) та MedCalc® (ver. 19.0.7).
Результати аналізу частоти виявлення ДНК вірусів за допомогою ПЦР в реальному часі
Проведений аналіз дозволив встановити, що частота відсутності ДНК вірусів в обох групах була однаковою, у 54 (46,6%) хворих основної групи в структурі пухлини вірусної ДНК виявлено не було, а в контрольній групі вірусна ДНК відсутня у 17 (34,0%) обстежених (р = 0,13). У решті когорти обстежених достовірно частіше реєструвалася ДНК вірусу Епштейна – Барр (ЕБВ) – у 40 (34,48%) хворих основної групи (р < 0,0001) і 15 (30,00%) здорових добровольців (р = 0,03). Плоскоклітинний рак слизової оболонки порожнини рота був достовірно частіше асоційований з ДНК вірусів папіломи людини як в загальному в 48 (41,4%) випадках (p < 0,0001), так і по розглядуваним підтипам: ВПч-6,11 – 16 (13,8%) (p = 0,005), ВПч-16 – 12 (10,3%) (p = 0,001), ВПч-18 – 20 (17,2%) (р < 0,0001). У контрольній групі ДНК ВПч виявлялася достовірно частіше тільки в загальному – 27 (54,0%) (р < 0,0001), і в ВПч-18 – 24 (48,0%) (р < 0,0001).
Проведений порівняльний аналіз частоти реєстрації вірусної ДНК в обох групах дозволив виявити наступні результати, представлені в таблиці 1.
В ході нашого дослідження була виявлена достовірно більш часта зустрічальність ДНК ВПч-18 в клітинах слизової оболонки порожнини рота здорових добровольців у порівнянні з хворими плоскоклітинним раком – в контрольній групі ВПч-18 виявлявся в 2,8 рази частіше (р < 0,0001).
Однак слід розуміти, що ДНК тільки одного типу вірусів в основній групі була виявлена лише у третини хворих – 34 (29,3%), а в контрольній – у 19 (38,0%) обстежених (р = 0,14). Два типи вірусної ДНК також однаково часто реєструвалися як в основній – 24 (20,7%), так і в контрольній – 14 (28,0%) групах (р = 0,16). Асоціація трьох або чотирьох типів вірусних ДНК виявилася тільки у хворих плоскоклітинним раком слизової оболонки порожнини рота – 3 (2,6%) і 1 (0,9%) (р = 0,26) (табл. 2).
Результати піданалізу комбінацій вірусів у структурі плоскоклітинного раку та нормальної слизової оболонки порожнини рота виявили достовірно більш часту асоціацію нормальної слизової оболонки порожнини рота з ВПч-18, як у моноасоціації – 19 (18,0%) випробуваних у контрольній групі в порівнянні з основною групою – 6 (5,2%) (р = 0,008), так і в комбінації з вірусом Епштейна – Барра: 7 (14,0%) (контрольна група) в порівнянні з 5 (4,3%) (основна група), (р = 0,03). Також достовірні відмінності отримані при аналізі комбінації ВПч-18 з цитомегаловірусом, яке було виявлено тільки в контрольній групі – 2 (4,0%) (p = 0,03). З іншого боку, поєднання ЕБВ з ВПч-16 було зареєстровано тільки у 6 (5,2%) хворих плоскоклітинним раком слизової оболонки порожнини рота з тенденцією до більш частого зустрічання подібної комбінації (р = 0,1).
Обговорення
Проведений нами аналіз дозволив достовірно показати, що відсутність асоціації слизової оболонки порожнини рота однаково часто зустрічається як у незміненій слизовій оболонці, так і в осередках плоскоклітинного раку, що дозволяє говорити про співставність розглянутих пацієнтів.
В ході дослідження нами була зареєстрована більш часта виявленість ДНК вірусу папіломи людини 18 типу в структурі нормальної слизової оболонки порожнини рота, як в моноасоціації, так і в комбінації ВПч-18 з іншими типами вірусів (ЕБВ, цМВ). Подібні дослідження і схожі результати, в основному в відношенні ВПч-18, були отримані, наприклад, ще Yeudall W. A. і Campo M. S. (Великобританія) в 1991 році: з допомогою ПцР проаналізували 25 зразків нормальної слизової оболонки порожнини рота, в 8% яких вдалося виявити ДНК ВПч-18, коли в структурі плоскоклітинного раку ДНК ВПч-18 виявлялася в 20,5% випадків з 39 обстежених. Однак дані літератури неоднозначні: наприклад, Saghravanian
N. з співавторами (Іран) в 2011 році проаналізували 18 зразків нормальної слизової оболонки і 21 зразок плоскоклітинного раку слизової оболонки порожнини рота і виявили, що в незміненій слизовій ДНК ВПч-16 і ВПч-18 не виявилася ні в одному зразку, а в осередках плоскоклітинного раку було 3 (14,3%) позитивних аналізи на ці типи вірусів. У 2017 році Liu T. з співавторами (Китай) з допомогою імуногістохімічного аналізу проаналізували частоту асоціації 22 зразків нормальної слизової оболонки порожнини рота і в 6 зразках плоскоклітинного раку з ВПч 16 і 18 типів, де ДНК вірусів була виявлена в 62,5% випадків групи здорових добровольців і у всіх 6 (100%) пацієнтів з онкопатологією. Результати нашого дослідження достовірно показують, що плоскоклітинний рак слизової оболонки порожнини рота частіше асоційований з ДНК вірусів папіломи людини як в загальному в 41,4% (48) випадків, так і по окремим вірусним підтипам: ВПч-6,11 – 13,8%, ВПч-16 – 10,3%, ВПч-18 – 17,2%, тоді як в нормальній слизовій ДНК ВПч виявлялася достовірно частіше тільки в сукупності – 54,0% і в випадку ВПч-18 типу – 48,0%, в порівнянні з іншими підтипами, які зустрічалися значно рідше.
Російських досліджень, присвячених розглядуваному питанню, вкрай мало, можна сказати, що вони одиничні, і кількість обстежених у них дослідженнях малочисельні. Одним з останніх досліджень є робота Кирьянова с. А. з співавторами, представлена в кінці 2019 року: автори обстежили 10 пацієнтів з плоскоклітинним раком слизової оболонки порожнини рота на наявність ДНК ВПч і ЕБВ за допомогою реакції ПцР в реальному часі, і виявили, що ДНК ВПч не зустрічалася ні в одному зразку пухлинної тканини, а от ДНК ЕБВ була виявлена в 7 (70,0%) випадках. У нашому дослідженні ДНК вірусу Епштейна – Барр (ЕБВ) була виявлена тільки у 34,48% (40) хворих плоскоклітинним раком слизової оболонки порожнини рота і у 30,00% (15) здорових добровольців.
Аналіз отриманих даних дозволяє припустити, що виявлення ДНК ВПч 18 типу в клітинах плоскоклітинного раку слизової оболонки порожнини рота може бути фактором сприятливого течії захворювання, а показники виживаності та ефективність протипухлинного лікування у даної когорти пацієнтів будуть переважати над аналогічними показниками ВПч-18-негативних хворих. Таким чином, проведення нашого дослідження на значному клінічному матеріалі, можливо, по-новому дозволить подивитися на віруси як достовірний етіологічний фактор розвитку плоскоклітинного раку слизової оболонки порожнини рота. Особливу увагу, на нашу думку, слід приділити асоціації плоскоклітинного раку слизової оболонки порожнини рота з ВПч-18, як ймовірного етіологічного фактора розвитку злоякісного переродження структур слизової оболонки порожнини рота. Однак, без сумніву, потрібно подальше глибоке вивчення даного питання, з метою визначення дійсної ролі вірусного фактора в розвитку і течії плоскоклітинного раку слизової оболонки порожнини рота.
Кутукова С.І., Чухловин А.Б., Яременко А.І., Іваськова Ю.В., Розумова А.Я., Єрмакова Т.С.
Список літератури
Стан онкологічної допомоги населенню Росії у 2018 році. Під ред. А. Д. Капріна, В. В. Старинського, Г. В. Петрової. Москва: МНІОІ ім. П.А. Герцена – філіал ФГБУ «НМІЦ радіології» Мінздрава Росії, 2019. іл. 236. ISBN 978-5-85502-250-6. [The status of cancer care for the population of Russia in 2018. Ed. A. D. Kaprina, V. V. Starinsky, G. V. Petrova. Moscow: MNII them. P.A. Herzen – a branch of the Federal State Budgetary Institution Scientific Research Center for Radiology of the Russian Ministry of Health, 2019. ill. 236. ISBN 978-5-85502-250-6. (In Russ.)].
Y. K. Chen, H. C. Huang, L. M. Lin, C. C. Lin. Первинний оральний плоскоклітинний рак: аналіз 703 випадків на півдні Тайваню. Oral Oncol. 1999;35:173-179. https://doi.org/10.1016/s1368-8375(98)00101-8.
P. A. Reichart. Визначення груп ризику для оральних передракових станів і раку та профілактичні заходи. Clin Oral Investig. 2001;5:207-213. https://doi. org/10.1007/s00784-001-0132-5.
J. H. Meurman. Інфекційні та дієтичні фактори ризику орального раку. // Oral Oncol. 2010;46:411-413. https://doi.org/10.1016/j.oraloncology.2010.03.003.
W. A. Yeudall, M. S. Campo. ДНК вірусу папіломи людини в біопсіях оральних тканин. Journal of General Virology. 1991;72:173-176. https://doi. org/10.1099/0022-1317-72-1-173.
N. Saghravanian, K. Ghazvini, S. Babakoohiet та ін. Низька поширеність високих ризиків генотипів вірусу папіломи людини в нормальній оральній слизовій, оральній лейкоплакії та веррукозному карциномі. Acta Odontologica Scandinavica. 2011;69:406-409. https://doi.org/10.3109/00016357.2011.572560.
T. Liu, H. Zhang, X. Yang та ін. Дослідження експресії p16 та вірусу папіломи людини 16 та 18 (E6) в ОЛП та його злоякісній трансформації. Pathology – Research and Practice. 2018;214(2):296-302. https://doi. org/10.1016/j.prp.2017.09.014.
Кирьянов С. А., Левіна Т. А., Поляков А. П., Ребрикова І. В., Мурашко Д. А., Коноплева М. В., Семененко Т. А., Суслов А. П. Виявлення геномної ДНК вірусу Епштейна-Барр у тканинах раку слизової оболонки порожнини рота російських пацієнтів. Питання вірусології. 2019;64(3):112-117. https://doi. org/10.18821/0507-4088-2019-64-3-112-117. [S. A. Kiryanov, T. A. Levina, A. P. Polyakov, I. V. Rebrikova, D. A. Murashko, M. V. Konopleva, T. A. Semenenko, A. P. Suslov. Detection of Epstein-Barr virus genome in oral cavity squamous cell carcinoma samples of Russian patient. Problems of Virology, Russian journal. 2019;64(3):112-117. (In Russ.)]. https://doi.org/10.18821/0507-4088-2019-64-3-112-117.